聚丙烯酰胺凝胶电泳_范文大全

聚丙烯酰胺凝胶电泳

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【专家解析】聚丙烯酰胺凝胶电泳

【优秀范文】聚丙烯酰胺凝胶电泳

问题一:聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳的异同?

DNA电泳一般使用的都是琼脂糖凝胶电泳,电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。

聚丙烯酰氨(PAGE)凝胶电泳用于蛋白质与寡糖核苷酸的分离。电泳的驱动力靠与蛋白质结合的SDS上所携带的负电荷。蛋白质电泳(一般指SDS-PAGE)根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。

所以相同点就是样品都是带负电荷的,从负极向正极移动,移动的距离都和样品的分子量有关。而且这两个电泳体系可以互相交换使用。进行大分子蛋白质电泳时,可以考虑换用琼脂糖凝胶,因为该体系孔径大。相反,如果需要精确到各位数碱基的DNA电泳也可以使用聚丙烯酰胺凝胶系统,因为使用该系统可以将相差一个碱基的两条DNA链分开。

不同点首先是样品不同。这个就不用多说了。其次是结果的观察方法不同。DNA电泳普遍使用EB做染料,在紫外灯下观察;而蛋白电泳使用的考马斯亮蓝染色,还需要经过脱色步骤,不过观察起来比较简单。还有就是胶体系的差阀,DNA电泳通常是一胶跑到底,而蛋白质电泳则会有分离胶和浓缩胶之区别。

电泳中样品移动的本质确实是样品所携带的电荷。但是,区分这些条带直接可以用分子量而无需使用电荷数,是因为这些样品的电荷/分子量比都是恒定的了。以DNA分子为例,它在电泳中的移动是靠其骨架中磷酸所携带的负电荷来实现的,而这个磷酸分子又是每一个核苷酸中都有的,所以DNA分子所携带的负电荷数是由其核苷酸总数决定的。而且,DNA分子中核苷酸的组成动辄成百上千,在如此大的分子量面前,讨论单个核苷酸之间分子量的差别就显得毫无意义。这样,DNA分子中负电荷的量就可以用DNA的分子量来代替,反过来,DNA的分子量也就可以用DNA分子所携带的电荷来代替(一句话,DNA分子的电荷/分子量比是恒定的)。

这在蛋白电泳中(特别是SDS-PAGE中)是一样的。在SDS-PAGE中,SDS将蛋白质变性成直线分子并紧密包裹于其上,使得其所携带的电荷与蛋白分子量成了一定的比例,剩下的就和核酸电泳一样了。

至于为什么核酸的横着跑,蛋白竖着跑,个人认为最大的问题是蛋白制胶的过程导致的。蛋白制胶由于使用了两种不同的凝胶系统,所以需要一个水平的分界面。这个分界面在配胶的过程中是依靠异丙醇在重力作用下的压力下形成的。所以,一并就竖着跑了~~

问题二:解释聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理,最好清晰点

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳是以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的一种区带电泳,由于此种凝胶具有分子筛的性质,所以本法对样品的分离作用,不仅决定于样品中各组分所带净电荷的多少,也与分子的大小有关。其次,聚丙烯酰胺凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应,即在电泳开始阶段,由于不连续pH 梯度的作用,将样品压缩成一条狭窄区带,从而提高了分离效果。

聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构,很少带有离子的侧基,惰性好,电泳时,电渗作用小,几乎无吸附作用,对热稳定,呈透明状,易于观察结果。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂的作用下,聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。

还要结合聚丙烯酰胺凝胶电泳三个不连续,即:凝胶孔径不同、缓冲液pH不同、缓冲液离子成分不同

和三个效应:浓缩效应、电荷效应、分子筛效应来一起说

问题三:你知道变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的那个胶是怎么配置的?需要哪些必备药品?还有用水平电泳可以吗?

我把我们实验室的实验讲义发给你,供你参考。

你做的应该是蛋白质的电泳吧,只能用垂直电泳。水平电泳用于分离DNA或RNA。

实验十一 SDS-PAGE检测表达蛋白

1.目的

学习SDS-PAGE的基本操作,学会用SDS-PAGE检测蛋白。

2.原理

蛋白质在加热变性以后与SDS结合,带上负电荷,在电场的作用下,向正极移动,结果按分子量大小排列在胶板上,含量多的蛋白带纹粗。

3.器材

旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml 微量离心管,双面离心管架,台式冷冻离心机,制冰机,超声波破碎仪,电磁炉,电泳仪,垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子等,摇菌试管,三角烧瓶,接种环,饭盒。

4.试剂

SDS(十二烷基磺酸钠),Acr(丙烯酰胺),Bis(N,N’-亚甲基双丙烯酰胺),Tris(三羟甲基氨基甲烷),甘氨酸,盐酸,Aps(过硫酸氨),TEMED(四甲基乙二胺),蛋白分子量标准(97.4,66.2,43,31,20.1,14.4 kDa),溴酚蓝,甘油,冰醋酸,乙醇,b-2-巯基乙醇,考马斯亮蓝R250,甲醇,乙醇。

5.实验准备

1.0mol/L Tris HCl,pH8.8(4°C保存);0.5mol/L Tris HCl,pH6.8(4°C保存);10%SDS(室温保存);30%Acr/Bis(30g Acr+0.8g Bis dd water 定容至100mL,4°C保存);10%Aps (-20°C保存);2´上样缓冲液(0.5mol/L Tris HCl,pH6.8 2mL,甘油2mL,20%SDS 2mL,0.1%溴酚蓝 0.5mL,b-2-巯基乙醇 1.0mL,dd water 2.5mL,室温存放);5´电泳缓冲液(Tris 7.5g ,甘氨酸36g,SDS 2.5g,加dd water至500mL,使用时稀释五倍);考马斯亮蓝染色液(考马斯亮蓝R250 0.25g + 45ml甲醇+10mL冰醋酸,用dd water定容至100mL);脱色液(95%乙醇:冰醋酸:水= 4.5:0.5:5,体积比);

6.操作步骤

(1) 将表达后的菌体与2´上样缓冲液按1:1混匀于微量离心管中。

(2) 用超声波破碎仪脉冲10次,每次10秒。中间间隔时放入冰中降温。注意一定要将超声波探头插入容液底部,在溶液表面或上部时容易起泡!

(3) 将上述微量离心管插入水漂中,放在电磁炉锅里的沸水中煮3~5min。然后立即插入冰中。(可在-20°C冰柜中保存)。

(4) 组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住(观察教师的演示)。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm的地方做一个标记。

(5) 配制10%分离胶。按顺序和量取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中(注意Tris为 pH8.8):

Acrylamide-bis 3.96 mL

1M Tris PH8.8 4.38 mL

d.d Water 3.432 mL

10% SDS 118.8 mL

TEMED 9.9 mL

10%APS 118.8 mL

(6) 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后,立刻缓缓倒入玻璃夹缝中,直到液面......余下全文>>

问题四:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳原理上有何不同?

最大的不同是 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)用的蛋白质不做任何变性处理

SD郸-PAGE中的SDS是十二烷基磺酸钠,是蛋白质变性剂,SDS能拆散蛋白质的折叠结构,然后沿伸展的多肽链的表面吸附。使肽链带净负电荷,蛋白质在电场中的泳动速度仅与蛋白质颗粒大小有关。

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